一、目的

       1.了解熒光法測定核黃素的原理和方法

       2.學(xué)習(xí)熒光光度計的操作和使用

       3.掌握熒光定量分析工作曲線

二、原理

       核黃素（維生素B2)是一種異咯嗪衍生物，其水及乙醇的中性溶液為黃色，并且有很強(qiáng)的熒光，這種熒光在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中易被破壞。核黃素可被亞硫酸鹽還原成無色的二氫化物，同時失去熒光，因而樣品的熒光背景可以被測定。二氫化物在空氣中易重新氧化，恢復(fù)其熒光，

三、實(shí)驗(yàn)器材

       1.核黃素片（5mg/片）

       2.熒光光度計

       3.容量瓶100ml（*2）

       4.試管1.5cm*15cm（*7）

       5.吸管10.0ml（*1），5.0ml（*1），2.0ml（*1），0.50ml（*2）

       6.量筒1000ml（*1），100ml（*1）

四、實(shí)驗(yàn)試劑

       1．核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取核黃素10mg，放入預(yù)先裝有約50ml蒸餾水的1000ml容量瓶中，加入 5ml 6mol/ L 乙酸，再加入大約800ml水，置水浴中避光加熱直至溶解，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至1000ml，混勻。

       2．連二亞硫酸鈉（保險粉）或亞硫酸鈉。

       3.  36％乙酸。

五、操作

    1．標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

       將配好的10ug/ ml 標(biāo)準(zhǔn)核黃素溶液，按表50所示比例稀釋成六個標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    2．樣品溶液的配制

       將被測的樣品（如核黃素藥片、維生素 B 針劑等）參照標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量范圍和溶劑體系配制成測定溶液。對于食物和生物材料中的核黃素測定，一定需要事先經(jīng)過抽提，或經(jīng)過分離，純化處理。

    3．熒光測定

       參照附錄六中熒光光度計的使用說明，選用濾色片，核黃素?zé)晒鉁y定的激發(fā)光波長為460nm，發(fā)射光波長為520nm。因此可選用帶迪型400nm（藍(lán)色）濾色片為激發(fā)光濾色片，選用截止型510nm（紅色）濾色片為發(fā)射光濾色片。待儀器預(yù)熱并調(diào)好零點(diǎn)后，用0號標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.5ug/ ml ）作為參比溶液調(diào)熒光光度計的熒光強(qiáng)度讀數(shù)到滿刻度（100%)，分別測定其他標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的相對熒光強(qiáng)度，在測定中如果樣品溶液的熒光強(qiáng)度超出100％則需要再行稀釋，在每一個測定溶液測定完后，需要重新倒回到相應(yīng)的試管內(nèi)。

    4,  數(shù)據(jù)處理

       每一個測定溶液的熒光強(qiáng)度讀數(shù)矯正公式為：F=F1+F2

       式中 F：校正后的熒光強(qiáng)度；

               F1：未還原時測得的熒光強(qiáng)度：

               F2：還原后測得的熒光強(qiáng)度。

       以標(biāo)準(zhǔn)溶液校正后的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的含量為橫坐標(biāo)，作出核黃素測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品溶液校正后的熒光強(qiáng)度在工作曲線上查出相應(yīng)的含量。

六、注意事項

       在所有操作過程中，要避免核黃素受陽光直接照射。